Pregabalin er ikke en GABAA- eller GABAB-receptoragonist.
Pregabalin er et gabapentinoid og virker ved at hæmme visse calciumkanaler.Specifikt er det en ligand af det ekstra α2δ-underenhedssted i visse spændingsafhængige calciumkanaler (VDCC'er), og virker derved som en inhibitor af α2δ-underenhedsholdige VDCC'er.Der er to lægemiddelbindende α2δ-underenheder, α2δ-1 og α2δ-2, og pregabalin viser lignende affinitet for (og dermed mangel på selektivitet mellem) disse to steder.Pregabalin er selektivt i sin binding til α2δ VDCC-underenheden.På trods af at pregabalin er en GABA-analog, binder det ikke til GABA-receptorerne, omdannes ikke til GABA eller en anden GABA-receptoragonist in vivo og modulerer ikke direkte GABA-transport eller metabolisme.Imidlertid har pregabalin vist sig at producere en dosisafhængig stigning i hjerneekspressionen af ​​L-glutaminsyredecarboxylase (GAD), enzymet ansvarligt for syntetisering af GABA, og kan derfor have nogle indirekte GABAerge effekter ved at øge GABA-niveauer i hjernen.Der er i øjeblikket ingen evidens for, at virkningerne af pregabalin medieres af nogen anden mekanisme end hæmning af α2δ-holdige VDCC'er.I overensstemmelse hermed ser pregabalins hæmning af α2δ-1-holdige VDCC'er ud til at være ansvarlig for dets antikonvulsive, analgetiske og anxiolytiske virkninger.
De endogene α-aminosyrer L-leucin og L-isoleucin, som ligner pregabalin og de andre gabapentinoider i kemisk struktur, er tilsyneladende ligander af α2δ VDCC-underenheden med lignende affinitet som gabapentinoiderne (f.eks. IC50 = 71 nM for L- isoleucin), og er til stede i human cerebrospinalvæske i mikromolære koncentrationer (f.eks. 12,9 μM for L-leucin, 4,8 μM for L-isoleucin).Det er blevet teoretiseret, at de kan være de endogene ligander af underenheden, og at de kompetitivt kan antagonisere virkningerne af gabapentinoider.I overensstemmelse hermed, mens gabapentinoider som pregabalin og gabapentin har nanomolære affiniteter for α2δ-underenheden, er deres styrker in vivo i det lave mikromolære område, og konkurrence om binding af endogene L-aminosyrer er blevet sagt at være ansvarlig for denne uoverensstemmelse.

Pregabalin viste sig at have 6 gange højere affinitet end gabapentin til α2δ-underenhedsholdige VDCC'er i en undersøgelse.En anden undersøgelse viste imidlertid, at pregabalin og gabapentin havde lignende affiniteter for den humane rekombinante α2δ-1-underenhed (Ki = henholdsvis 32 nM og 40 nM).Under alle omstændigheder er pregabalin 2 til 4 gange mere potent end gabapentin som et smertestillende middel, og hos dyr ser det ud til at være 3 til 10 gange mere potent end gabapentin som et antikonvulsivt middel.